用途：该技能用于PCR/qPCR引物和寡核苷酸设计，可为目标DNA区域设计正/反向引物对，计算Tm与退火温度，并对引物对做会引发PCR失败的二级结构质检。
主要能力：一是设计引物对，tu run DNA_primer_design 传入 sequence（完整模板）、target_start、target_end、tm_target、product_size_min、product_size_max，返回 forward_primer / reverse_primer（序列、tm、gc_content、长度、位置）与 product_size；二是计算Tm/退火温度，tu run NEB_Tm_calculate 传入 primer_sequence、primer_sequence_2、polymerase、primer_concentration、monovalent_salt_mm，返回各引物Tm和所选聚合酶推荐Ta；IDT_analyze_oligo 可补充GC%、分子量和发夹/自二聚体筛查，DNA_calculate_gc_content 用于快速GC检查；三是质检，scripts/primer_qc.py 按GC夹、3′自/交叉互补、连续碱基、GC%、长度、Wallace/NN Tm、Tm匹配等规则检查任意来源引物并标出问题。
使用要点：target_start..target_end 是扩增子必须覆盖的区域，需满足大致 product_size_min ≤ 目标跨度 ≤ product ≤ product_size_max，且两端有足够侧翼序列，否则会报“Target region 小于 product_size_min”或“product does not cover the target”。Tm取决于方法与条件，SantaLucia NN、NEB、IDT 参数集不同且随盐、Mg²⁺、引物/dNTP浓度变化，应统一计算器与条件，勿混比，并注明条件。设计规则参考：长度18–24 nt、Tm 58–62 ℃、配对ΔTm<3 ℃（最多≤5）、GC 40–60%、3′末端1–2个G/C且不超过3、避免3′互补与≥4连续相同碱基。
限制：工具不检查基因组特异性，必须自行BLAST（或Primer-BLAST）确认单一目标产物；也不做SNP屏蔽；热力学预测不等于实测表现，需梯度PCR验证。模板GC富集或发夹结构可能阻断退火。