用途：规划如何把 DNA 片段拼接成构建体，设计 Gibson 重叠区或 Golden Gate 的 Type IIS 粘端，并规避内部酶切位点、非唯一连接等常见失败。
方法选择：少量片段、任意位置无缝连接、一次性构建用 Gibson；多部件、标准化可复用部件（MoClo/模块化）、一锅法或组合文库用 Golden Gate。Gibson 无连接疤痕，Golden Gate 留下 4 bp 融合疤痕。
Gibson 设计：调用 tu run DNA_gibson_design，传入按组装顺序排列的 fragments 与 overlap_length，返回每个片段的 left_overlap、right_overlap 和 with_overlaps（已加同源臂，可交给 primer-design）。规则：重叠 15–40 bp（常用 20–25），重叠 Tm 约 48–65 °C 且各连接处均衡；避免重复序列与二级结构；各连接处同源必须唯一，否则片段会互换。
Golden Gate 设计：调用 tu run DNA_golden_gate_design，传入 parts 与 enzyme（如 BsaI），返回 parts_with_overhangs，含每个部件唯一的 4 bp 左右粘端及带 Type IIS 识别位点的完整序列。规则：必须做 domestication，所选酶位点（BsaI GGTCTC、BbsI GAAGAC）不得出现在部件内部，需用沉默突变去除；粘端必须唯一且非回文；避免高 GC 或全 AT 粘端，可参考高保真粘端集合；组装顺序由粘端决定而非列表顺序。
质控：scripts/cloning_qc.py 可筛查内部 BsaI/BbsI 位点、粘端唯一性/回文、Gibson 重叠 GC 与长度，并给出 PASS/WARN。
限制：这些工具只设计连接处，不模拟完整连接/外切酶反应，也不保证效率，需测序验证；不检查载体骨架或 ORF 读框，需自行确认。生成片段仍需用 primer-design 设计带同源臂或 Type IIS 尾的引物并做 BLAST 特异性检查。