用途
该技能面向从头酶设计：给定化学反应或底物，构建催化基序（过渡态或共价中间体的三维坐标，含催化侧链原子和配体），将其支架化到新的蛋白骨架上，并通过源自反应机理的过滤器对设计进行评分、排序和分诊。它也可用于对已有酶设计集进行过滤、打分或优化已具活性的设计（回收支架/局部扩散）。不适用于无催化化学的结合剂或界面设计，也不适用于单纯的结构预测。
主要能力
核心模型为 AlphaProtein Novo（AP Novo）：一个条件联合序列-结构扩散模型（1.475 亿参数，32 个块），以固定催化基序和固定配体原子为条件，同时生成骨架坐标和序列。因为序列与结构协同生成，LigandMPNN 重测序步骤是可选的。
流程分为四个可独立运行的阶段：
- 生成（run_generator.py）：基序+配体 → 骨架+序列
- 重测序（run_ligandmpnn.py，可选）：在固定骨架上运行 LigandMPNN
- 折叠（run_alphafold.py）：按状态、按种子进行 AF3 / AF3-LA 预测
- 评估（evaluate_design.py）：计算指标并输出 04_eval/*_evaluation.json 和 evaluation_summary.csv
run_pipeline.py 可通过一个 JSON 清单运行全部四个阶段。在 ToolUniverse 中，apnovo 远程提供者覆盖基序验证、生成和重测序三项，不提供折叠操作，因为 AlphaFold 3 权重涉及单独的条款。上游评估要求存在折叠种子，因此 apnovo_evaluate_designs 在完成折叠前无法运行。
使用方式
阶段 1：定义反应并构建基序
需要在一个 CIF 文件中提供三维坐标：催化侧链原子和代表过渡态或共价中间体的配体，且处于期望酶保持的构象。需决定四件事：使用完整残基还是仅尖端原子（motif_atoms）；使用索引编号还是非索引编号（unindexed_motif_residues）；使用新支架还是局部扩散（partial_diffusion_*）；以及总长度（seq_length）。基序几何来源优先顺序：具有正确机制的自然酶晶体结构（搜索 PDB）、DFT 推导的 theozyme、或 RDKit 生成的配体构象对接到天然三联体。已发表的活动均使用过这三种来源。基序是主导变量：在一项匹配比较中，Asp/Glu 催化碱基的命中率为 37%（32/86），而 His 碱基为 10%（9/87），流程和过滤器相同。
阶段 2：先验证基序规格
motif_str 字段的语法需正确，例如 A1,5-10,A5-6,3/B1，其中 | 可随机化片段顺序。is_author_naming: true 表示使用作者编号。在生成前用 apnovo_validate_motif 操作解析 CIF 和 motif 字符串，报告解析后的片段长度、固定原子和配体链。该步骤无需权重和 GPU，可避免在阶段 6 才发现问题而浪费 GPU 时间。
阶段 3：生成骨架
默认参数：num_sampling_steps: 1000（已发表活动值，结论在 200 时也成立），每个基序的 num_designs 在数百量级。长度采样示例：Kemp 消除酶中间片段 2–80 残基、末端 10–100；丝氨酸酯酶中间片段 2–70、末端 5–100，总长限制在 100–250；硝烯转移酶可设计片段 1–278 位于血红素配位 His 两侧，总长 60–280。
阶段 4：重测序（可选）
设置 resequence.enabled: false 可直接折叠 AP Novo 协同生成的序列。在两种反应上，AP Novo 序列的计算机通过率和实测活性与 LigandMPNN 序列相当。使用 LigandMPNN 时，温度为 0.1，权重 v_32_030_25，标准流程中每个设计生成一条序列。要求设计在两种序列模型下都通过过滤器本身也是一种过滤：回顾性命中率从 29% 提升到 45%（Kemp），从 5% 提升到 15%（丝氨酸酯酶）。
阶段 5：折叠所有机理状态
枚举机理经过的所有状态并分别折叠。例如丝氨酸水解酶有五个状态：apo、es（米氏复合物，非共价）、ti1（第一个四面体中间体，共价，sp³）、aei（酰基酶，共价，sp²）、ti2（第二个四面体中间体）。每个状态是清单中的一个条目，指定其配体和蛋白-配体键。每个状态的种子数：Kemp 为 7，丝氨酸酯酶/DEHP 为 10。每个 AF3 trunk 种子内部采样 5 个结构并返回排名最高的，因此一个 trunk 种子产生一个预测。AF3 与 AF3-LA 的选择：标准 AF3 对离去原子处理不当，在共价四面体中间体的 Ser Oγ 处产生约 180° 键角（正确应为约 109°）；AF3-LA 是修复此问题的微调版本，丝氨酸酯酶和 DEHP 活动使用了它。若机理包含共价中间体，这点很重要；否则 Kemp、卡宾和硝烯第一轮使用了标准 AF3。
阶段 6：评估与过滤
指标命名格式为 <state>/<metric>/<seed_or_aggregate>，外加 sampled/*（扩散输出）和 sequence/*（序列合理性）。先在 seed_0 上过滤，再在跨种子的聚合上过滤。报告累积漏斗，以便看出哪个过滤器在起作用。
阶段 7：骨架集成评分（MR / MPD）
这是已发表流程中价值最高的步骤。多重重测序（MR）：固定骨架，生成 N 条序列，根据其中通过过滤器的数量给骨架打分。丝氨酸酯酶：10 次重测序，通过标准为 10/10；Kemp：7 次，通过标准为 6/7 然后 7/7。多局部扩散（MPD）：同样思路向外一层——以 1000 步中的 575 步重新加噪设计（与亲本约 88–90% 序列一致性，约 0.5 Å 骨架 RMSD），生成 10 个，要求 9/10 通过。实测效果：MR（Kemp）回顾性在 50% 召回率下提升 2.5 倍，前瞻性命中率 23%（2 倍）；MR（丝氨酸酯酶）回顾性在 50% 召回率下提升 5.4 倍，前瞻性最高 44%（30 倍）；MR+MPD 均 10/10 时，Kemp 60%，丝氨酸酯酶 80%。该指标估计骨架可访问的功能序列空间体积，需要先有反应特异性指标，因此并非反应无关。
阶段 8：分诊、新颖性检查与报告
声称新颖性前需检查。自然拓扑标志定义：与 PDB 中任何同类别注释酶的 TM-score > 0.45 且支架对齐的催化三联体 RMSD < 5 Å。在已发表的丝氨酸酯酶中，16.4% 的设计满足该定义，且催化效率排名前七的设计中有六个满足。应分别报告最佳设计和最佳非自然拓扑设计。每个设计需报告：通过的指标、失败的指标、漏斗位置、最大 TM-score 和与任何天然序列的最大序列一致性，并明确说明计算机通过率是活性的弱代理。
适用场景
适用于：为特定反应或底物设计酶；将催化基序/活性位点支架化到新蛋白；过滤、评分、排序或分诊已有酶设计集；决定哪些设计值得订购及原因；优化已具活性的设计（回收支架/局部扩散）。
限制
- 权重许可：AP Novo 生成器权重仅限非商业使用（大学、非营利组织、研究机构、教育、新闻、政府）。输出受 AP Novo 输出使用条款约束，分发时必须保留其通知，发表时必须引用论文。禁止使用政策禁止源自或针对毒素、毒液、毒力因子、受管制病原体或化生武器前体的基序、配体或底物，禁止规避基因合成筛选。开展活动前应阅读 src/tooluniverse/remote/apnovo/README.md。
- 远程提供者不包含折叠操作，需自行安排结构预测提供者，阶段 6 和 7 依赖其输出。
- 计算机通过率不是活性，只能对设计进行评级，不能承诺活性。
- 基序是主导变量；若活动失败，应先重新检查基序而非调整过滤器。
- 必须用英语进行工具调用查询。
- 科学事实不确定时应先搜索数据库，而非凭记忆推理；分析需要计算时应编写并运行 Python 代码，而非描述。
参考文件
FILTERING.md：指标命名空间、漏斗代码、五套已发表阈值、如何为新反应构建阈值集。CAVEATS.md：该流程不做什么、已发表的失败模式、许可条款。