SuperAPI AI 工具集
合作ENAI 行业资讯收藏
Skill 广场bulk-rnaseq

bulk-rnaseq

数据与分析

查看项目

更新于 10-22 03:28

技能介绍

Bulk RNA-seq 是一个端到端的批量 RNA-seq 差异表达分析编排技能，覆盖从原始测序读数到富集通路与图表的完整流程。它本身是一个路由器，而非重新实现：大多数阶段已有专用技能，本技能负责按正确顺序连接它们，填补原始读数到基因水平计数矩阵之间的空白，并强制执行决定最终结果是否可信的设计与质控决策。

【用途】 当用户希望从 FASTQ 文件（或一次测序运行）得到差异表达基因与通路；运行或配置 nf-core/rnaseq，或使用 STAR、Salmon、featureCounts 进行比对/定量；将 Salmon/STAR/featureCounts 输出转换为可供 DESeq2/PyDESeq2 使用的计数矩阵；在投入计算前设计或检查批量 RNA-seq 实验（重复数、批次、链特异性）；或规划端到端 RNA-seq 分析并决定串联哪些工具与技能时，可使用本技能。本技能针对批量 RNA-seq（样本为生物标本）。单细胞/单核数据应使用 scanpy；仅做差异表达统计使用 pydeseq2；仅做富集使用 pathway-enrichment。

【主要能力】 流程为：FastQC/修剪 → 比对/定量（STAR/Salmon）→ 计数 → 差异表达（pydeseq2）→ 富集（pathway-enrichment）→ 图表。

读数到计数阶段有两条上游路径，二者产生等效的基因计数，需根据情境选择其一并保持一致：

  • 路径 A — nf-core/rnaseq：适合希望使用领域标准、经过审计、可引用的单命令流程；样本多或需扩展到 HPC/云；可复现性与完整 MultiQC 报告最重要。通过 nextflow 技能驱动。
  • 路径 B — 独立工具：适合样本少、希望学习/检查每一步；没有 Nextflow/容器或环境受限；需要流程未暴露的非标准步骤。参考 references/upstream-manual.md。 不确定时优先路径 A。两条路径都汇聚到基因水平计数矩阵，之后工作流完全相同。

本技能拥有计数到差异表达之间的桥接阶段：scripts/build_counts_matrix.py 将定量输出转换为 pydeseq2 所需格式。支持 Salmon（--from salmon，使用 pytximport 以 counts_from_abundance="length_scaled_tpm" 聚合到基因水平，需要 tx2gene 映射）、STAR（--from star，读取 ReadsPerGene.out.tab 并按 --strandedness 选择列）、featureCounts（--from featurecounts，解析合并矩阵）。输出 counts.csv（基因×样本，整数）和 metadata_template.csv。

【使用方式】 安装本技能的粘合部分：uv pip install pytximport pandas。下游技能自行安装依赖：pydeseq2 技能安装 pydeseq2；pathway-enrichment 技能安装 gseapy gprofiler-official。路径 A 只需 Nextflow 与容器引擎；路径 B 通过 bioconda 安装并固定版本，例如：conda create -n rnaseq -c bioconda -c conda-forge fastqc fastp trim-galore "star=2.7.11b" "salmon=1.10.3" subread multiqc。需记录所用确切版本（流程修订、工具版本、参考基因组与注释版本）。

路径 A 快速开始：先用 python scripts/validate_samplesheet.py --samplesheet samplesheet.csv 验证样本表；用 nextflow run nf-core/rnaseq -r 3.26.0 -profile test,docker --outdir test_results 做冒烟测试；真实运行：nextflow run nf-core/rnaseq -r 3.26.0 -profile docker --input samplesheet.csv --genome GRCh38 --aligner star_salmon --outdir results -resume。nf-core/rnaseq 内部运行 tximport，基因计数已合并，无需桥接脚本，使用 results/star_salmon/salmon.merged.gene_counts_length_scaled.tsv 做差异表达。

路径 B 快速开始（简略）：fastqc 做原始读数质控；fastp 修剪接头/低质量；salmon quant 逐样本定量。完整配方见 references/upstream-manual.md。

计数到差异表达再到富集（两条路径通用）：路径 B 先用 python scripts/build_counts_matrix.py --from salmon --quant-dir quant/ --tx2gene tx2gene.tsv --output-dir counts/ 组装计数矩阵与元数据模板；然后交给 pydeseq2（counts.csv + metadata.csv → 差异表达表）、pathway-enrichment（按 stat 排序做 GSEA，或按 padj+|LFC| 命中列表做 ORA）、scientific-visualization/matplotlib（火山图、MA 图、热图、PCA、富集点图）。

【分阶段工作流】 自上而下执行，不要跳过设计与质控阶段：

  1. 设计与样本表：确认每组≥3 个生物学重复，识别批次/混杂因素，选择比较组，构建样本表并用 scripts/validate_samplesheet.py 验证。
  2. 原始读数质控：逐文件 FastQC，用 MultiQC 汇总，检查每碱基质量、接头含量、重复、过表达序列。
  3. 修剪：用 fastp 或 Trim Galore 去除接头与低质量尾部，重跑 FastQC 确认。
  4. 比对/定量：STAR（基因组比对 + --quantMode GeneCounts）和/或 Salmon（转录本准映射，decoy-aware）。确定链特异性。
  5. 构建计数矩阵：用 scripts/build_counts_matrix.py 将定量输出转为基因×样本整数矩阵与元数据模板。
  6. 差异表达：交给 pydeseq2 技能，加载 counts.csv + metadata.csv，设定设计（如 ~batch + condition），拟合并以 FDR 控制检验，检查 PCA 与 p 值直方图。
  7. 富集：交给 pathway-enrichment 技能，GSEA 按 DESeq2 stat 排序全基因列表，ORA 传阈值化命中列表（padj < 0.05，可选 |log2FC| > 1），先映射基因 ID 到符号。
  8. 图表：交给 scientific-visualization 技能，绘制火山图、MA 图、样本距离热图、PCA、富集点图，并附 MultiQC 报告。

【适用场景】 从 FASTQ 到差异表达基因与通路的完整分析；配置 nf-core/rnaseq；使用 STAR/Salmon/featureCounts 比对定量；将定量输出转为 DESeq2/PyDESeq2 计数矩阵；批量 RNA-seq 实验设计检查；端到端分析规划与工具串联。

【限制与常见陷阱】

  • 重复数过少：每组<3 个生物学重复几乎没有功效且离散度估计不稳定，更多重复优于更深测序。
  • 批次与条件混杂：若处理组与对照组在不同日期/泳道处理，效应不可恢复；应随机化并建模已知批次。
  • 链特异性错误：选错 STAR 列或 featureCounts -s/Salmon 文库类型会静默丢弃约一半读数；使用 Salmon -l A 或推断链特异性并验证分配读数比例。
  • 向 DESeq2 输入 TPM/FPKM：DESeq2 需要原始（或长度缩放）计数，绝不能用 TPM/FPKM/归一化值。
  • 非整数计数：PyDESeq2 要求整数，Salmon 估计值需四舍五入（桥接脚本会处理）。
  • 富集时基因 ID 不匹配：DESeq2 输出常为 Ensembl ID，而 Enrichr/MSigDB 需要符号，需先映射。
  • 跳过定量后质控：信任差异表达前务必查看 PCA 与样本距离热图。
  • 跨样本混用比对器：所有样本须用同一工具、版本、参考与参数。
  • 版本未固定："latest" 流程/基因组使结果不可复现，需固定 -r、工具版本与基因组/注释版本。

【与其他技能的集成】 上游执行：nextflow（运行 nf-core/rnaseq，路径 A；HPC/云/容器）。参考数据/基因 ID：gget、database-lookup、biopython/pysam。差异表达：pydeseq2。富集：pathway-enrichment。图表与报告：scientific-visualization、matplotlib、seaborn；scientific-writing。相关但不同：scanpy（单细胞）、statistical-analysis（多重检验深度）。

【参考文件】 references/upstream-nfcore.md（路径 A）、references/upstream-manual.md（路径 B）、references/counts-and-handoff.md（计数交接）、references/design-and-qc.md（设计与质控）。

【资源】 nf-core/rnaseq: https://nf-co.re/rnaseq · STAR: https://github.com/alexdobin/STAR · Salmon: https://salmon.readthedocs.io · fastp: https://github.com/OpenGene/fastp · Trim Galore: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore · MultiQC: https://multiqc.info · pytximport: https://pytximport.complextissue.com · featureCounts (Subread): https://subread.sourceforge.net。方法背景：Love et al. 2014 (DESeq2) DOI 10.1186/s13059-014-0550-8；Soneson et al. 2015 (tximport) DOI 10.12688/f1000research.7563.2。