用途：把配对 FASTQ 经质控、定量、转录本到基因折叠、差异检验、收缩与可视化，产出带注释的基因层差异表达表（ENSG+symbol+biotype、log2FC、stat、pvalue、padj、baseMean）。
主要能力：负责各步骤间的衔接决策，而非单步内部机制。主路径为 fastp → Salmon（decoy-aware）→ tximport → DESeq2 → lfcShrink(apeglm) → VST/火山图；备选路径为 STAR+featureCounts（需 BAM 时）。
关键约定：参考释放版本与转录组/GTF 必须同源，否则重命名转录本会静默丢失；基因 ID 以 ENSG 为骨架，仅在报告阶段转 symbol/Entrez；原始整数计数才可输入 DESeq2/edgeR/limma-voom，TPM/CPM 仅用于样本内排序，VST/rlog 仅用于 PCA、聚类、热图与机器学习；转录本到基因折叠须经 tximport 以携带平均转录本长度偏移，不可直接累加 NumReads；批次写入设计公式（~ batch + condition），不可先校正再检验。
必要用法示例： salmon index -t gentrome.fa -d decoys.txt -i salmon_index -k 31 -p 8 salmon quant -i salmon_index -l A -1 trimmed/${s}_R1.fq.gz -2 trimmed/${s}_R2.fq.gz -o quants/${s} --gcBias --seqBias -p 8 txi <- tximport(files, type = 'salmon', tx2gene = tx2gene, ignoreTxVersion = TRUE) dds <- DESeqDataSetFromTximport(txi, colData = coldata, design = ~ batch + condition) dds <- dds[rowSums(counts(dds)) >= 10, ] dds <- DESeq(dds) res <- lfcShrink(dds, coef = 'condition_treated_vs_control', type = 'apeglm') STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir star_index --genomeFastaFiles genome.fa --sjdbGTFfile genes.gtf --sjdbOverhang 149 --runThreadN 8 featureCounts -T 8 -p --countReadPairs -s 2 -a genes.gtf -o counts.txt aligned/*_Aligned.sortedByCoord.out.bam
适用场景：批量 RNA-seq 基因层差异表达分析；需要基因组 BAM 时选 STAR 路径；文库大小差异超 3 倍或离群值多时倾向 limma-voom，需紧致有限样本 I 类错误控制时用 edgeR-QL。
限制：需先确认工具版本（DESeq2 1.42+、tximport 1.30+、apeglm 1.24+、STAR 2.7.11+、Salmon 1.10+、Subread 2.0.2+、fastp 0.23+、ggplot2 3.5+）；apeglm 收缩对象会丢弃 stat 列，GSEA 排序需从未收缩 results() 取 Wald stat；链特异性不可假设，需用 ReadsPerGene.out.tab 第 3/4 列或 infer_experiment.py 确认；低计数预过滤仅为速度/内存步骤，不替代 results() 的 baseMean 独立过滤。完整可运行脚本见该技能的 examples/（salmon_deseq2_workflow.R、star_deseq2_workflow.sh）。