用途：针对可变剪接（AS）分析对 RNA-seq 数据做专门质控。剪接分析在读长、深度、建库方式、比对策略和注释选择上比差异表达更苛刻，任一层失败都会静默偏倚 PSI 估计并抬高新连接假阳性。决策顺序为：实验设计→建库→比对策略→注释→诊断指标。
主要能力与检查层：
- 实验设计审查：读长、深度、重复数、建库类型。建议 rRNA 去除建库（内含子保留分析必须）、PE 100-150nt、50-100M reads/样本、链特异性文库、每组 n≥3。
- STAR 两遍比对：先每样本发现新连接，合并队列新连接后再比对，队列式两遍优于每样本 basic 两遍。示例命令保留：STAR --runMode alignReads --genomeDir genome_index --sjdbGTFfile gencode.v45.basic.gtf --sjdbOverhang 149 --readFilesIn sample_R1.fq.gz sample_R2.fq.gz --readFilesCommand zcat --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --outSJtype Standard --alignSJoverhangMin 8；合并用 cat pass1_*_SJ.out.tab | awk '$5 > 0 && $7 >= 3' | sort -u > cohort_novel_SJ.tab。
- 连接饱和度：junction_saturation.py -i sample.bam -r gencode_v45.bed -o sample_junc_sat -m 50，判断已知连接曲线是否平台化。
- 新连接比例：junction_annotation.py 分类并计算 known/novel 比例，≥80% 健康，<60% 需排查。
- 连接 overhang 与覆盖：用 pysam 解析 CIGAR 的 N 操作，overhang <8nt 常见假阳性。
- 剪接位点强度：maxentpy 的 score5/score3 与 SpliceAI，MaxEnt<5 提示弱/隐蔽位点。
- 其他：Picard CollectRnaSeqMetrics、geneBody_coverage.py、infer_experiment.py 验证链特异性、fastq_screen 查 rRNA 污染、GENCODE basic 与 comprehensive 注释选择。
限制：资料未提供安装方式、收费与平台信息；版本兼容需自行核对（RSeQC 5.0+、STAR 2.7.11+、samtools 1.19+、pysam 0.22+、regtools 1.0+、maxentpy 0.0.1+、spliceai 1.3+、matplotlib 3.8+、pandas 2.2+）。