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bio-rna-quantification-tximport-workflow

数据与分析

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更新于 10-15 21:55

技能介绍

用途:把 Salmon/kallisto/RSEM 等产生的转录本水平定量文件导入 R,汇总为基因水平计数,并生成每个基因、每个样本的平均长度偏移,供 DESeq2 或 edgeR 做基因水平差异表达分析;也可保留转录本水平用于差异转录本使用(DTU)分析。

主要能力:tximport 不只是把转录本计数相加,而是返回 txi$counts、txi$abundance(TPM)、txi$length(长度偏移来源)。countsFromAbundance 决定正确性:默认 'no' 返回估计计数加独立长度偏移,适合全长文库配 DESeq2/edgeR;'lengthScaledTPM' 把长度校正并入计数,适合不能接收偏移的工具(如 limma-voom);'scaledTPM' 用于转录本水平 DTU;'dtuScaledTPM' 按中位异构体长度缩放。3' 端建库(10x、QuantSeq、Lexogen)读段计数不随转录本长度变化,应使用默认导入但用 DESeqDataSetFromMatrix(round(txi$counts), ...) 构建,避免自动施加长度偏移。

tx2gene 为两列数据框,列顺序必须是 TXNAME 在前、GENEID 在后,可由 GTF(txdbmaker::makeTxDbFromGFF)、biomaRt 或索引 t2g 生成。常见静默失败是转录本 ID 版本后缀不一致,可用 ignoreTxVersion = TRUE、ignoreAfterBar = TRUE 或统一去除版本号解决。

用法:tximport::tximport(files, type='salmon', tx2gene=tx2gene);DESeq2 用 DESeqDataSetFromTximport(txi, colData=coldata, design=~condition) 自动应用偏移;edgeR 需手动对长度矩阵做几何均值中心化、结合组成校正文库大小取对数后经 scaleOffset 附加。注意不要重复施加偏移。tximeta 通过校验和识别参考序列来源,自动附加转录本区间与版本元数据,可用 makeLinkedTxome 与 tximeta(coldata)、summarizeToGene 构建。

适用场景:全长文库的基因水平差异表达、转录本水平 DTU、需要参考来源可追溯的分析。

限制:需保证定量文件与注释的 ID 一致;版本不匹配会静默丢弃转录本;3' 端建库不应使用长度缩放模式;转录本水平检验需额外处理不确定性(catchSalmon、swish/fishpond、sleuth)。资料未提供具体收费、平台与效果信息。