用途：为批量 RNA-seq 分析提供决策逻辑，帮助在比对型定量（STAR+featureCounts）与无比对定量（Salmon）之间选择，确定链特异性，并规避 DESeq2 建模中常见错误。适用于选择定量路线、从两种计数来源搭建 DESeq2、以及排查计数异常偏低或差异表达信号偏弱等场景。
主要能力与决策逻辑：若需 BAM（变异检测、融合基因、新转录本）则走 STAR 两遍比对加 featureCounts，否则用 Salmon（更快、内存更低、偏差校正）。Salmon 结果进入 DESeq2 时使用 DESeqDataSetFromTximport 保留长度偏移，切勿对 txi$counts 取整后传给 DESeqDataSetFromMatrix。过滤策略上，样本数 ≥30 可采用类似 VQSR 的思路，<30 时仍可用但需更激进预过滤。
关键参数：--sjdbOverhang 取 readLength-1（默认 100），非 100bp 读长需调整；差异表达始终使用 --twopassMode Basic；Salmon 始终开启 --gcBias --seqBias 与 --validateMappings。featureCounts 的 -s 依建库试剂盒而定，必须经验验证；DESeq2 预过滤用 rowSums(counts >= 10) >= smallest_group，浅测序时调整阈值；lfcShrink 类型用 "apeglm"，任意对比用 "ashr"；设计公式形如 ~ batch + condition，关注变量放在最后。
链特异性判定：TruSeq Stranded/dUTP 对应 featureCounts -s 2、Salmon -l ISR（双端）或 SR（单端）；Ligation/forward 对应 -s 1、ISF 或 SF；无链特异性对应 -s 0、IU 或 U。可用 RSeQC 的 infer_experiment.py 或 Salmon 的 lib_format_counts.json 经验验证，计数前必须确认。
常见错误与限制：凭猜测设定链特异性会导致计数降低 2–10 倍、差异信号变弱；向 DESeq2 传入 TPM/FPKM/CPM 等归一化值会破坏负二项模型，必须从原始整数计数开始；变量顺序错误会使检验对象出错；需在创建 DESeq 对象前断言 stopifnot(all(colnames(cts) == rownames(coldata)))；低计数基因不预过滤会增加运行时间并稀释多重检验校正；Stranded 文库误用 STAR ReadsPerGene.out.tab 第 2 列（无链特异性）会使有效计数减半，应使用第 3 或第 4 列；应剔除或标记比对读段 <10M 或比对率 <70% 的样本；批次与条件完全混杂时无法建模，需先检查 table(coldata$batch, coldata$condition)。资料未提供具体安装命令与代码示例。