用途
Binding Characterization 是针对 SPR（Surface Plasmon Resonance，表面等离子体共振）与 BLI（Biolayer Interferometry，生物膜层干涉）结合表征实验的指导性技能。适用场景包括：规划结合动力学实验，以及排查结合信号弱或无信号等问题。
SPR 与 BLI 对比
技能提供了一张决策矩阵，用于在两种技术之间选择，比较维度如下：
- 灵敏度：SPR 适合小分子、片段（<500 Da）；BLI 适合大复合物、抗体。
- 通量：SPR 为低至中等（串行）；BLI 为高（96 孔并行）。
- 样品纯度：SPR 有要求（会堵塞流路）；BLI 可耐受粗裂解液。
- 动力学分辨率：SPR 较高（更适合快速动力学）；BLI 较低。
- 质量传输：SPR 更敏感（可能扭曲 kon）；BLI 较不敏感。
- 维护：SPR 高（流路系统）；BLI 低（浸入即读）。
- 样品消耗：SPR 较高（连续流）；BLI 较低。
- 单次实验成本：SPR 芯片成本低、运行成本高；BLI 探针成本高、运行成本低。
关键技术差异
SPR：检测金表面的折射率变化；表面为带葡聚糖基质（CM5、CM7 等）的金芯片；连续微流控；最适合小分子、高亲和力、精确的 kon/koff 测定。
BLI：测量光学干涉图样位移；表面为光纤生物传感器探针（SA、Ni-NTA、AHC）；浸入即读（无微流控）；最适合高通量、粗样品、抗体筛选。
故障排查
技能分别列出「BLI 可用但 SPR 不可用」以及「SPR 可用但 BLI 不可用」的成因与解决方案。
BLI 可用但 SPR 不可用的常见原因包括：疏水性 CDR 吸附到 SPR 金/葡聚糖表面（可加 0.05% Tween-20、使用葡聚糖更长的 CM7 芯片）；聚集导致 SPR 流路中的质量传输伪影（过滤样品 0.22μm、降低配体密度）；高不稳定性在连续流中降解（缩短循环时间、添加稳定剂如 5% 海藻糖）；电荷不匹配导致对带电葡聚糖的非特异结合（缓冲液 pH 距 pI 调整 ±1、加 1 mg/mL BSA）；慢解离需要长时间再生（损伤配体）（改用 BLI，探针一次性）。
SPR 可用但 BLI 不可用的常见原因包括：小分析物（BLI 对 <10 kDa 灵敏度较低，改用合适芯片的 SPR）；弱亲和力（KD >10μM，BLI 浸入过程中解离快，可提高分析物浓度）；低表达导致信号不足（提高生物传感器载量）。
质量传输考量
当分析物无法足够快地扩散到表面以维持平衡时，就会出现质量传输限制，从而扭曲动力学参数。
症状包括：观测 kon 比真实 kon 慢；结合相呈线性（而非指数）；kon 随配体密度变化；Rmax 随流速变化。
何时需要考虑质量传输：高亲和力相互作用（kon >10^6 M^-1s^-1）；高配体密度（>500 RU）；低流速（SPR 中 <30 μL/min）；大分析物（扩散慢）。
缓解策略（SPR / BLI）：降低配体密度（SPR：高亲和力时 <200 RU；BLI：<0.5 nm 位移载量）；提高流速（SPR：50-100 μL/min；BLI：提高振荡速度 1000 rpm）；使用定向固定（His 标签捕获 / 生物素化配体）；在拟合中加入质量传输模型（kt）（SPR）；BLI 通常不太关键。
非特异性结合的缓解
缓冲液添加剂按有效性排序：BSA（0.5-1 mg/mL，封闭疏水位点，通用）；Tween-20（0.02-0.05%，防止表面吸附，适合疏水分析物）；海藻糖（1-5%，稳定 + 封闭，适合不稳定蛋白）；蔗糖（5%，BLI 专用封闭剂，用于 BLI 探针）；羧甲基葡聚糖（1 mg/mL，竞争性封闭，用于 SPR 带电荷蛋白）；NaCl（150-500 mM，减少离子相互作用，用于带电荷蛋白）。
pH 优化原则：保持缓冲液 pH 与分析物 pI 至少相差 1 个单位。pI 接近 7 时使用 pH 6.0 或 8.0 缓冲液；酸性蛋白（pI <5）使用中性或碱性缓冲液；碱性蛋白（pI >9）使用偏酸性缓冲液。
参照扣除：始终包含空白参照通道（无配体）、仅缓冲液注射、非特异性结合对照。
再生条件
SPR 再生筛选（按顺序尝试）：10 mM 甘氨酸 pH 2.0-2.5（多数蛋白-蛋白，可能使配体变性）；10 mM 甘氨酸 pH 1.5（强相互作用，剧烈，限制暴露时间）；1-2 M NaCl（离子相互作用，温和，可先试）；10 mM NaOH（非常稳定的配体，可能水解蛋白）；10 mM 甘氨酸 pH 9-10（酸稳定蛋白，可能聚集）；10 mM EDTA（His 标签、金属依赖，会剥离 Ni-NTA）；4 M MgCl2（疏水相互作用，需检查配体稳定性）。
再生流程：从最温和条件（高盐）开始；测试 30 s 接触时间；确认完全解离（回到基线）；确认配体活性保留（重复结合）；使用最短有效接触时间。
BLI 探针：通常一次性（无需再生）。如需复用：条件同 SPR，但暴露时间更短。Anti-His 探针：10 mM 甘氨酸 pH 1.5，30 s。链霉亲和素探针：通常不可再生。
常见伪影与解决方案
双相结合：症状为两速率的结合或解离；原因为样品异质性（聚集）、配体异质性（多种构象）、亲合力效应（二价分析物）；解决方案为过滤/离心样品、使用单价 Fab 片段、降低配体密度、拟合异质模型。
负解离：症状为解离阶段信号上升；原因为配体从表面渗漏、分析物在表面聚集、参照通道漂移；解决方案为使用捕获抗体替代直接固定、提高缓冲液严格性、更好地参照扣除。
钩状效应：症状为高分析物浓度下信号下降；原因为表面饱和 + 重结合抑制、拥挤效应；解决方案为缩小分析物浓度范围、降低配体密度、使用更小的分析物片段。
动力学数据质量检查清单
分析之前：正确扣除参照；缓冲液注射显示平坦基线；各浓度 Rmax 一致；结合相无系统性漂移；再生完全（回到基线）；重复/三次注射结果一致。
拟合质量：残差随机分布（无系统性偏差）；Chi² < Rmax 的 10%（或低信号时 < 1 RU²）；kon 和 koff 误差 < 数值的 20%；动力学 KD 与平衡 KD 一致（3 倍以内）；拟合 Rmax 合理（接近理论值）。
危险信号：kon 接近质量传输极限（>10^7 M^-1s^-1），此时速率不可靠；koff 太快无法采样（> 0.1 s^-1）或在解离窗口内太慢无法测量（< 10^-5 s^-1）；Rmax 远大于理论最大值（聚集或亲合力）；动力学与平衡 KD 差异很大。